服務熱線
021-66030766
通常,一根色譜柱在分析數千個樣品之后性能仍然保持良好,但也有的色譜柱僅分析不多的樣品后幾乎就報廢了。影響色譜柱壽命和其它問題的因素很多,而有些因素是操作者很難控制的,如果被分析的樣品(如分析生物樣品),怎么凈化樣品也是“臟"的,對于色譜柱的影響是非常大的。然而采取下列措施后,在多數情況下總能夠人為地減少色譜柱上故障,達到延長壽命的目的。
色譜柱預防及維護—避免高壓沖擊
一般色譜柱都能經得起高壓,但經不起突然變化的高壓沖擊。引起高壓突然沖擊,主要是因樣品閥的緩慢轉動、泵起動快、柱切換操作等。轉動六通進樣閥時從泵到柱的液流會瞬時切斷。在閥的泵側壓力升高,在閥的柱側壓力降低(變化超過20%)。閥轉到底后壓力突然沖擊一下恢復正常。手動進樣閥的變化不大,自動進樣閥比較慢,可能造成壓力沖擊,可用氦氣代替空氣驅動進樣閥。因氮壓縮系數小。另外泵起動不應過快,可分步操作。如用3mL/min流速,先從lmL/min到2mL/min,然后再3mL/min,每個間隔應大于20s。柱切換技術的應用也很廣泛,切換過程中在色譜柱的入口處壓力在零到很大數字之間變化,會很快使柱報廢。
色譜柱預防及維護—分離條件
多數色譜柱有很寬的試驗條件范圍,但具體應用又受到限制,主要是pH值、柱溫和流動相的選擇。硅膠為基質的鍵合相要求PH在2.5~7之間,pH的流動相能“溶解"硅膠,使鍵合相流失。結果非堿性組分的保留不斷減少,堿性組分的保留增加,引起堿性組分峰變寬。如果一定要用高或低pH的流動相,可加預柱(飽和柱)。預柱裝在泵和進樣閥之間,用分析柱相同的填料填裝,或者用普通硅膠。硅膠飽和了流動相,減少了分析柱填料的損失。預柱不要求柱效高,用價格低的一般硅膠疏松地填裝,按期檢查硅膠的溶解情況。用預柱也有不利的影響,即新流動相難以平衡,保留時間不穩定或穩定慢。使用了預柱一定要加流路過濾器,以防止硅膠微粒引起的麻煩。以硅膠為基質的柱和陰離子交換柱超過60℃后,會增加對流動相中化學物質的吸附。在高溫下用小顆粒柱引起柱床塌陷,降低柱效,改變峰形。在40℃以上使用3μm柱,70℃以上使用5μm柱,會使值降低50%。
色譜柱預防及維護—加流路過濾器和保護柱
流路過濾器緊靠進樣閥后面,位于分析柱前。0.5μm燒結不銹鋼片夾在死體積很小的套子中,擋住來源于樣品和進樣閥墊圈的微粒入柱。因為每個樣品都過濾既費事又帶來誤差,樣品量少過濾更困難,因此流路上裝過濾器是比較省事的辦法。也可以在流路加上保護柱,放在流路過濾器和分析柱之間,或者代替流路過濾器。保護柱的使命是收集阻塞色譜柱進口的來自樣品的化學“垃圾"。這種垃圾zui終降低柱效能。保護柱是消耗品,分析50~100個比較臟的樣品之后就要調換新的。保護柱應該是小體積,用分析柱的同種填料填裝。保護柱使用得當,對分離無影響,好像未裝保護柱一樣。有些廠商的商品將保護柱和流路過濾器連在一個單元內,使用起來非常方便。自己填裝保護柱都是用短柱、不超過3cm長,內徑2~3mm,用較大粒度的填粒(15~20μm)干法填裝,會使分析柱效略微有所降低。
色譜柱預防及維護—用強溶劑定期沖洗色譜柱
每次工作結束,用強溶劑沖洗柱是良好的習慣。可用甲醇、乙腈沖反相柱,沖去留在柱上的強吸附組分。用甲醇水為流動相時也應沖洗。沖洗的程序在以下章節中介紹。柱頭的燒結不銹鋼濾片,要求平整,死體積小,孔徑適當(2~5μm)。過濾片選擇不好會改變色譜峰形,增加阻力或起不到阻擋污染物的作用(填料很快變色)。
色譜柱預防及維護—凈化樣品
用溶劑溶解的樣品,多數組分在一定的時間內能*從柱中流出來,不會造成危害。有些樣品可能含有微粒物質,樣品中的某種組分(如蛋白質)在柱頭上沉積下來,組分在固定相上保留很強,溶劑帶走柱填料等,這些都會造成柱效能下降或對柱壽命的影響,有必要采取措施防止柱變壞。
如在光線照射下觀察樣品是渾濁的或帶有乳白色,進樣前必須要過濾.雖然流路上裝有過濾器和保護柱,但不能代替樣品的前處理,樣品中過多的微粒會使過濾器和保護柱超載,很快阻塞,或者微粒進入分析柱,所以在進樣前必須過濾樣品。
若懷疑樣品與流動相混合有沉淀而對色譜柱有阻塞,應先試驗一下,看樣品溶液加入流動相中有無變渾或乳白色出現。如果進樣后壓力突然增加而后又慢慢減小,表明樣品中有微粒或發生沉淀。如有沉淀要設法改變分離條件,包括換樣品溶劑和流動相或處理樣品去掉不溶物質。應盡量用小體積的樣品。
有些樣品能很強地吸附在柱填料上,這樣會降低塔板數,改變樣品的保留物質外,還要加保護柱,定期清洗色譜柱。有時因為疏忽,用對柱有害的溶劑溶解樣品,比如用6mol/L的氫氧化鈉溶解樣品,這樣的樣品只要進50~100μL到硅膠基質柱中,硅膠就很快溶解而使柱報廢。在這種情況下,應立即中和樣品,或除去原溶劑中的有害成分。
綜上所述,如何保護良好的柱性能與柱壽命:
1.認真閱讀色譜柱使用說明書;
2.使用填充良好的色譜柱;
3.盡量減少壓力波動,避免機械及熱沖擊;
4.使用保護柱及在線過濾器;
5.經常以強溶劑沖洗色譜柱;
6.充分過濾樣品及流動相,盡量避免雜質微粒與強保留成分;
7.用穩定的固定相(C18zui穩定);
8.在中等pH值操作時(6~8),用有機緩沖溶液;
9.色譜柱使用溫度小于40℃;
10.硅膠基質的色譜柱,應保持流動相的pH值范圍在3.0~8.0;
11.在水流動相與緩沖溶液中加200ppm的疊氮鈉;
12.流動相中含有緩沖溶液,應注意用95:5的水及有機溶劑過濾,有機溶劑不能低于5%;
13.貯存時,沖洗掉鹽和緩沖液,用純有機溶劑流動相保存。
聯系方式
郵件:sh-jiapeng@163.com